双荧光素酶检测启动子和荧光定量检测启动子有什么不同

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。

发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。

 
 



这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。
 
二、荧光素酶报告基因的检测流程

1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；
2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；
3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；
4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；
5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；
6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。

三、荧光素酶报告基因的优点

1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；
2、内源性低，哺乳动物无内源性表达；
3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；
4、发光检测，检测方便；
5、灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；
6、检测范围广，大于7个数量级。