有限稀释法是一种常用的克隆方法。
将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数,计出1mL的细胞数。
用HT培养液稀释, 使细胞浓度为50~60个/mL,于96孔培养板中每孔加0.1mL(五六个细胞/孔)。
接种2排,剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释,再接种2排,如此类推,直至使每孔含0.5~1个细胞。
培养7~10d后,选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复3~5次,直至达100%阳性孔率时即可,以确保抗体由单个克隆所产生。
例如:
实验细胞克隆化培养技术—有限稀释法
一、实验目的:
1、掌握用有限稀释法进行细胞克隆化培养技术; 2、学会细胞克隆形成的辩观察技能;
3、配合抗体分泌细胞筛选技术,确定抗体分泌细胞。 二、实验原理:
克隆化培养即单细胞培养技术,用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养,可以及时确定阳性杂交瘤细胞株,同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌阴性细胞株。
一般杂交瘤细胞需经过52—3次反复克隆后,才能达到100%细胞阳性率。
该办法亦适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择,识别和分离。是细胞株的常用方法。
三、实验材料:
杂交瘤细胞、25毫升培养瓶、96孔细胞培养板(天津有机玻璃厂)、移液管(1毫升、5毫升、10毫升)、弯头滴管、倒置显微镜、CO2培养箱、白细胞计数板、计数器、盖玻片、防水笔、RPMI-1640、小牛血清、青链霉素、10毫升刻度离心管,00橡胶塞,饲养细胞(3-6×105/ml、见腹腔细胞的制备)。
四、实验步骤:
1、分装了每孔0.1毫升腹腔细胞的96孔细胞培养板(可提前24小时准备就绪,置CO2培养箱中备用);
2、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞(亦可自24孔培养板孔中收集),制成悬液。
3、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数,一般在105/毫升左右。
4、取3支10毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上,先用无血清培养基将细胞稀释至103/毫升,再用含15%小牛血清的完全培养基稀释到101/毫升细胞,即每0.1毫升1个细胞。
5、每孔0.1毫升细胞悬液。
6、置37℃5%CO2培养箱,4天后取出观察,并在板盖上打上标记,做好记录并统计结果。
7、继续培养时,则在第4-5天更换1/2培养基,约第7-9天可以收获培养液上清用于检测抗体。并重复检测1-2次。
8、选择单克隆生长孔,生长良好,阳性强者,转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。
五、实验结果:
实验结果以总细胞孔(如96孔)中出现克隆孔统计出克隆百分率,并可进一步按单细胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。
六、注意事项:
1、注意无菌操作,一旦发现污染(孔)必须及时处理;
2、计数细胞要求准确,稀释量亦要准确,否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分离太低;
3、在计数克隆出现率之前,不宜更换培养液,也不宜强烈振动培养板; 4、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清;
5、若做克隆抗体检测时,特别要保护细胞的生长状况,防止细胞生长不良甚至丢失。 七、说明:
哺乳动物细胞通过分离、稀释接种,培养在适宜于单细胞生长的培养液中,形成细胞克隆。运用这项技术可以制作细胞成活曲线,即在接种相同数量细胞的培养瓶中,加入不同浓度的化学品,或照以不同剂量的射线,观察其对细胞的听见害程度。由此可以在哺乳类细胞中进行诱变试验及分离突变细胞。