病原微生物的分子分型方法
近年来，随着分子牛物学技术快速发展，新的诊断技术和方法不断涌现并广泛应用于临床微生物的检测，为病原微牛物的致病性、流行性、变异性以及耐性分析等方面提供J，重要的信息。目前，应用分子生物学技术对病原微牛物进行分型的方法包括：脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gelelectrophoresis。PFGE)分型、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分型、生物芯片分型、多位点序列分型(muhilocus sequencetyping，MI。ST)、质粒DNA图谱分型以及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分型等。
1．脉冲场凝胶电泳分型PFGE技术以其重复性好、分辨力强而被誉为细菌分子分型的“金标准”。它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb，而普通琼脂糖凝胶电泳仅能分离小于500 Kb的DNA。PFGE的基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在凝胶中的DNA分子的泳动方向发
生改变，小分子DNA比大分子DNA泳动快，从『『ii在凝胶上按DNA分子大小呈现出特异的电泳图谱。病原微生物的基因组DNA经脉冲场凝胶电泳，使大片段DNA有效分离。DNA条带的密度反映了病原微生物基因组DNA的含量以及分子的大小，最终达到分型的目的。目前，PFGE已被广泛的应用于病原微牛物的分型，Swaminathan等∽J已经建立了针对大肠杆菌0157：H7、沙门菌属的Typhimurium血清型、李斯特菌、志贺菌属等病原微生物分型的标准PFGE操作方法。有研究认
为PFGE的分辨力强于核糖体分型和随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)分型。当采用1个限制件核酸内切酶的分辨力不强时，可以采用2种限制性核酸内切酶加以提高。当然，PFGE也有一些局限，如耗时长、成本高等。另外，电泳图谱易受操作人员技术水平等因素的影响，这为不同实验室问的比较带米一定困难¨
2．聚合酶链反脱分犁PCR技术自1985年发明以来，以其灵敏度高和特异性强受到了人们的高度重视，成为核酸扩增和检测的一种常规方法H]。用于病原微生物分子分型的PCR方法主要有RAPD分型和重复序列PCR分犁2种。RAPD是建移在PCR基础卜-的1种可对整个未知序列的基因
组进行多态性分析的分子生物学方法。该方法以基冈组DNA为模板，以单个人T．合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基)为引物，在热稳定的DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚内烯酰胺凝胶电泳后，对其进行多态性分析。反应小同基因组DNA特点，从而对病原微生物进行分型。RAPD可以在物种没有任何基因组信息的情况下分析其DNA多态性，对模板DNA的纯度要求不高。无需DNA探针和分子杂交。重复序列PCR分型足Versalovic于1996
年描述的1种细菌基因组指纹分析方法，即PCR扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，经电泳图谱比较分析揭示基因组间的差异[5]。研究表明重复序列PCR分型与RAPD分型有相同的分辨力[6]，但操作相对复杂。然而，重复序列PCR分型的再现性非常好，这是RAPD无法比拟的。此外，多重PCR、巢式PCR等也呵用于病原微生物的分型，虽然各有长处，但也存在分辨力弱、重复性差、结果解析困难等不足，因此，还未广泛应用于临床。
3．生物芯片分型 生物芯片技术是将生物大分子，如寡核苷酸、cDNA、基冈组DNA、肽、抗原以及抗体等固定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵，当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后，利．}}j激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析例。其用于病原微生物分型的基本原理是将代表各个亚型的特异基因制成1张芯片，经反转录就可检测样本中病原微生物的亚型进行辨别。液态芯片(suspension arraytechnology，SAT)，又称微球蛋白芯片(proteinbeadarrays，PBA)，是近年来出现的1种新的芯片技术。其原理是甩2种荧光染料按照不同比例将直径为5．6 ttm的微球染成100种颜
色，每种颜色的微球共价结合1种牛物探针，可以是抗原、抗体、配体，也可以是核酸或酶，分针对1种待检物。混合载有100种不同颜色的微球，就可以在1个反应孔里同时完成100种不同的生物反应。随后微球成单列通过2束激光照射的管道，计算机采集并处理每种颜色微球的荧光强度变化就可以分别对每个待测物进行定性或定量的检测。该系统口『用于多种微生物抗原、抗体和特定基因的联合检测。目前，该方法已应用于临床HPV的分型检测。与固态芯片相比，液态芯片在反
应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优势，因此，不少学者看好液态芯片的应用前景。
4．多位点序列分型 随着DNA测序技术的快速发展，分子分型日益趋向于染色体的单一或多个位点的多态性上。MI。ST分型是指测定对多个管家基囡中长度约为470 bp的核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。Maid—en等[83发现，MI，ST可用于脑膜炎奈瑟球菌的分型。他们认为，多个管家基因的序列分析比较在实验过程的ⅡI操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验窜问具有良好的可比性，即MLST对某哆菌株具有较强的种内分辨力【9 J。Chen等no]应用MLST对我国台湾地区12家分离到的51株白色假丝酵母菌进行遗传特征分析，结
果发现了7个管家基因序列的83个多态性位点和45个二倍体序列类型。其中，36．1％是同义突变，63．9 oA为非同义突变。他们认为，MI。ST的分辨力较PFGE更强，能分辨某患者所感
染的白色假丝酵母菌随时间推移『『ii发生的微小种内进化。但MLST的缺点是它的高额费用和操作过程所需的特定仪器。这使得这项技术只能局限在大型的全球性流行病学研究中心
使用，影响其在推广普及。
5．质粒DNA图谱分型 细菌质粒分析是较早被使用的病原微牛物分子分型方法。该方法包括萃取质粒DNA和琼脂糖凝胶电泳。由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同，
通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也不同，从而可以对不同菌株进行分型。菌株携带的质粒越多则质粒DNA图谱分型方法的特异性越强。质粒网谱分型的优点是操作相对简单，只需要简单的设备就可以完成，耗时短，费用低廉。但质粒图谱分型有一难以克服的缺陷。即质粒可以自发的丢失、获取以及在同种细菌甚至是在异种细菌之间转移，这就造成了质粒图谱的不稳定性。另外，质粒图谱型方法小能区分那些大小相同而DNA序列不同的质粒¨“。
6．限制性片段长度多态性分型 RFI。P是指基因组DNA经限制性核酸内切酶消化，消化后的片段再通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。用限制性核酸内切酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因组DNA，可以产生大量短的片段，通过电泳后得到的DNA图谱可用于病原微生物的分型。几乎所有
的病原微牛物分离株都町以通过这种方法分型，但由于基因组DNA巨大，酶切后产生的片段众多，且含有大量的莺叠片段，这使得蔚株间图谱的一致性分析面I临诸多用难口“。RFLP分
型分辨力弱于PFGE分型，且操作比较复杂。
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