单酶切可以用BstX I,双酶切可以用Spe I和EcoR V。原则上，你做单酶切鉴定需要你的插入片段前后都有的这个酶切位点，因为你的片段里面已有EcoR I,所以这个酶不能用，因为会切断内部PCR序列。对于双酶切，考虑的则是PCR片段前后不是共有的酶切位点。原则上，酶切位点离你的目的片段越近越好。
