我做TA克隆,准备拿序列去测序。做完转化以后直接做个菌液PCR检验一下是否有目的条带就可以了吧?

2024-12-12 10:44:06
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回答1:

菌液PCR有风险,因为PCR是有一个级联放大的效应在里面,只要在菌液中沾了一点转化时用的核酸片段,就有可能会扩增出来。但是送去测序的时候,很可能是假阳性,没有连入任何片段(以前我们就碰到过这种情况,而且还是通过蓝白斑筛选的)。
如果实在没有IPTG和X-gal,也最好能先挑几个单菌落去做菌落PCR,从中选取阳性的菌落去做液体摇菌,提质粒,找一个目标判断上有的酶做一个单切,同时用自连的空载作为对照,看是否能够切开。如果菌体克隆切开了,空载切不开,才能说明找到了阳性克隆。送去测序才比较可靠。
否则直接送去测序,很可能全是空载,白白耽误时间。
为了节省时间,也可以先送去测序,等待测序的过程中,进行酶切验证,对了更好,不对赶紧找其他的菌去送样。

回答2:

可以的,菌液PCR如果条带正确也是可以的

没加IPTG和X-gal的话就分不清是否是空载体还是已经转入基因了

回答3:

保险起见,提个质粒,做个酶切。当然咯,现在测序已经很便宜了!

回答4:

既然能扩出来就直接往下做

回答5:

做菌落PCR吧,跑个胶看看有没有插入片段