实际上不需要Primer Plus，手工设计足够了，因为需要设计的只有6个碱基而已。
首先，为你的miRNA 3'-端最后6个碱基写一段完全互补的序列，然后接在一段固定的茎环结构模板序列上，就完成了。
比如：
hsa-miR-10a: 5'- UACCCUGUAGAUCCGAAuuugug -3'
设计的引物就是：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcacaaa
注意到小写部分是跟miRNA最后6个碱基互补的。只有这6个碱基是专门为miR-10a准备，而引物的其他碱基序列都是通用的，这一大段额外增加的茎环结构固定序列是为了提高PCR的熔解温度。
Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27;33(20):e179.
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