引物设计的原则和试验目的是相关的。
如果是为了检测某一个片段有没有，那么只要考虑特异性和片段好不好扩就行了。一般片段大小控制在500bp左右，上下游引物在57-57度退火温度，引物互补情况不严重，不如不超过5个，单引物没有发卡结构，那么这样的引物就比较好用了。
但是如果是为了克隆基因，那么片段大小就固定了，我们只能在特定的一小段上设计上下游引物，只能尽量的在引物长度（尽量控制在21-25bp）、GC含量（尽量控制在40%-60%）等方面综合考虑。
引物设计的好，PCR的难度就降低了；引物设计的不好用，后续试验会有很大的难度。
如果有具体问题，可以逐一的提出具体的问，问的太笼统了不好回答。
祝你好运！不要太依赖软件。
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