生物植物基因工程 目前研究重点、方向、及最新成果

（1）病毒外壳蛋白（coat protein, CP）基因：在植物中表达病毒外壳蛋白基因可以阻止病毒的侵染或症状的产生。

病毒外壳蛋白的抗性机理：一种假说认为，当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后，它们立即被细胞中的自由CP所重新包裹，从而阻止了入侵病毒核酸的翻译和复制。在离体条件下，附加自由CP能够抑制末装配病毒的翻译的实验结果支持了上述假说；另一假说认为，抗性机制是在CP水平上抑制病毒脱壳，此说法最有力的证据是转基因植株可抗完整病毒的侵染．但不能抵御裸露病毒RNA的入侵；还有一种观点认为病毒外壳蛋白的抗性机制不是外壳蛋白在起作用，而可能是它的RNA转录物与入侵病毒RNA之间的相互作用

（2）病毒复制酶基因：RNA病毒（如烟草花叶病毒）的复制酶是依赖于RNA的RNA聚合酶。病毒复制酶一般是在病毒核酸进入寄主细胞并结合到寄主核糖体之后形成的。在植物中表达不完整的病毒复制酶基因可以显著提高植物对病毒的抗性，作用机制还不十分清楚，可能与基因转录后沉默有关。

下面是文献:

植物抗病毒基因工程

植物病毒病难以防治已成为植物界的“癌症”，给全球农业生产造成巨大的损失。有效地防治植物病毒病，减少经济损失，满足日益增长的世界人口需求。是农业生产当务之急。病毒分子生物学，植物基因工程的迅速发展，为筛选培育抗病、优质、丰产的新植物开辟了广阔的前景。自1986年，全球范围内兴起了多种利用分子生物学及基因工程研究成果防治植物病毒病害的策略，并成功地培育筛选出多种抗病毒的工程植物。

1．病毒外壳蛋白介导的基因工程抗病性

外壳蛋白是形成病毒颗粒的结构蛋白，它的功能是将病毒基因组核酸包被起来，保护核酸；与宿主互相识别，决定宿主范围；参与病毒的长距离运输等。1986年，美国的Beachy实验室的Powell－Abel等第一次将烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV－Cp）基因插入修饰过的农杆菌质粒中，并置于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子下，经农杆菌侵染而将TMV－Cp基因转入烟草，并在烟草中表达TMV－Cp，分子生物学检测表明TMV－Cp基因已整合到烟草的基因组中，并能稳定地遗传给子代，在转基因烟草中TMV－Cp表达量占叶蛋白0．1％左右。攻毒试验表明：转基因烟草能够抑制TMV的复制，在一定程度上降低或阻止TMV的系统侵染；并延迟发病12～30天。这一突破性的研究成果标志着植物抗病毒基因工程的诞生。自此科学家继续用黄瓜花叶病毒（CMV），马铃薯病毒X和Y，大豆花叶病毒（SMV），苜蓿花叶病毒（AiMV）等病毒的外壳蛋白基因导入植物体后，均得到类似的实验结果，使转基因植物获得对该病毒的抗性。至今世界各地科学家已在15个病毒组中的30多种病毒中，证实了由病毒外壳蛋白介导的抗病性，许多抗性工程植物相继进入大田试验。目前认为外壳蛋白介导的抗病性是比较成熟的植物抗病毒基因工程策略，有人认为其机制是外壳蛋白在转基因植物中的积累干扰了病毒脱衣壳，从而抑制了病毒在植物体中的复制，转运与积累，但许多实验结果预示其机制的复杂性。

2．复制酶介导的抗病性

复制酶即特异性依赖于病毒RNA的RNA多聚酶。是病毒基因组编码的自身复制不可缺少的部分，特异地合成病毒的正负链RNA。1990年Golemboski等报道他们将TMVU1株编码的复制酶的一部分基因序列，即54kD蛋白基因转入烟草中得到的工程植株用很高浓度的TMVU1（500μg/mL）及TMV RNA（300μg/mL）接种时，均表现出很高的抗性，比一般转外壳蛋白基因的植物介导的植物抗病性高得多。后来豌豆早枯病毒54kD的蛋白基因和CMVFny RNA2编码的切去活性中心部位GDD（Gly－Asp－Asp）的复制酶部分基因片段转入烟草，均获得了高抗的工程植物。此外在马铃薯病毒X和Y中也报道了同样成功的研究结果。转入的这些基因均为切除了复制酶活性中心部位GDD核苷酸序列，大多数人认为表达的这些不稳定蛋白产物会干扰病毒复制过程中复制酶复合体的形成及其功能的行使，从而使工程植株具有抗病性。复制酶策略很有应用前景。

3．卫星RNA介导的抗病性

卫星RNA是独立于病毒基因组之外，依赖于其辅助病毒复制的小分子RNA，是病毒分子寄生物。我国田波实验室自1981年首次在国际上开展了利用卫星RNA防治病毒病害的研究工作，结果表明黄瓜花叶病毒（CMV）卫星RNA作为生物防治因子能有效地防治由强毒株系CMV引起的严重病害。1986年英国Baulcombe等首次将CMV I－17N卫星 RNA以双联体基因形式转入烟草，并得到抗CMV的工程植物。此后陆续将烟草环斑病毒和CMV的卫星RNA转入烟草和番茄中并得到抗病植株。一般认为由卫星RNA介导的抗病机制是卫星RNA与病毒RNA竞争复制酶，从而干扰病毒基因组的复制，使表达卫星RNA工程植株得到保护。因具卫星RNA的病毒数量很少，使卫星RNA介导的抗病性的应用受到限制。

4．反义RNA和核酶策略

反义RNA对基因表达具有一定的抑制作用，尤其在细菌中，与转录起始区互补的反义RNA最为有效。在真核生物中，与3′-末端序列互补的反义RNA有一定的抑制作用。Baulcombe等1987年和Cuozzo等1988年分别得到烟草环斑病毒的4个基因组RNA的反义序列和CMV－Cp反义序列的转基因植株。转基因工程株未获得对病毒的抗性或只表现微弱的抗性。Day等1991和Lindo等1992分别在双生病毒番茄金黄叶病毒和烟草蚀纹病毒上得到转反义RNA的抗性烟草。

核酶是一种高效特异的RNA内切酶，其结构包括一个几乎完全相同的17个高度保守核苷酸序列，其中有3对碱基配对形成的茎和环结构，整个结构很象一个锤头，具自我切割的活性，锤头结构是自身切割活性的结构基础。只要已知某一RNA的序列，就可以设计出用于不同目的核酶进行特异地切割。因为植物病毒大多数是RNA病毒，并且许多已被测序，可以设计出特定的核酶，切割病毒RNA基因，从而破坏其生存的功能，达到抗病毒的目的。目前由核酶介导的抗病毒策略也成功的报道。但是也存在一定的危险性，核酶也有可能将生物体内的有用的RNA作为耙子进行切割，破坏正常细胞的生理功能。以反义RNA和核酶介导的抗性还有待于进一步的研究。

5．复合基因策略

由外壳蛋白基因，缺损复制酶基因和卫星RNA介导的抗病性是比较成熟的研究策略。但这些工程植株抗病性有一定的局限性，例如转基因植物只抗一种病毒或抗亲缘关系较近的病毒。自然界中往往是几种病毒复合侵染植物。1990年Lawson将马铃薯病毒X和Y的外壳蛋白基因串联后转入马铃薯中，使转基因马铃薯表现出对这两种病毒的抗性。而且抗性高于转单一基因的对照植株。

6．其它抗病毒策略

封闭和干扰病毒的移动蛋白。病毒侵染植物体后，可以移动进行系统侵染，这种移动被认为是通过病毒编码的移动蛋白与胞间联丝相互作用，打开胞间联丝通道而进行的。封闭和干扰移动蛋白就可以限制病毒的扩散侵染。

植物抗体基因策略。1989年，Hiatt等将分泌特异性抗体的杂交瘤中得到的抗体的重链和轻链基因片段转入烟草，在转化株中表达了抗体的重链和轻链，通过表达重链和轻链的单株杂交，其后代体内得到完整的具有免疫活性的抗体。目前许多抗体基因在转基因植物体中得到表达，并用于防治植物病毒病。这表明动物的免疫系统同样能够在植物体内发挥抗病毒的作用。

缺陷RNA策略。Marsh等1991年在原生质体体系中发现缺陷型的雀麦花叶病毒RNA可以干扰野生病毒的增殖。缺陷干扰RNA在动物病毒中普遍存在，然而植物病毒中仅存在于Tombvirus和Carmovirus两个病毒组中，能干扰辅助病毒的复制，增强或减弱辅助病毒的症状由缺陷干扰RNA介导的抗病性还在探索中。

另外植物体自身的一些抗病毒的基因也被克隆，并用于抗病毒植物基因工程中。

目前随着植物分子生物学，植物生理学，病毒分子生物学的发展以及基因工程技术的不断完善，将会出现更有效更安全的抗植物病毒的策略。

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