在蛋白质合成过程中，肽键的形成是在核糖体的大亚基内。
核糖体在细胞中负责完成“中心法则”里 由RNA到蛋白质这一过程，此过程在生物学中被称为“翻译”。在进行翻译前，核糖体小亚基会先与从细胞核中转录得到的信使RNA（messenger RNA，简称“mRNA”）结合，再结合核糖体大亚基构成完整的核糖体之后，便可以利用细胞质基质中的转运RNA（transfer RNA，简称“tRNA”）运送的氨基酸分子合成多肽。当核糖体完成对一条mRNA单链的翻译后，大小亚基会再次分离。
翻译的具体过程是：氨基酸分子在氨基酰-tRNA合成酶的催化作用下与特定的转运RNA结合并被带到核糖体上。一个激活的tRNA进入核糖体的A位与mRNA相配，肽酰转移酶在邻近的氨基酸间建立一个肽键，此后在P位上的氨基酸离开它的tRNA与A位上的tRNA结合，核糖体则相对于mRNA向前滑动，原来在A位上的tRNA移动到P位上，原来在P位上的空的tRNA移动到E位上，然后在下一个tRNA进入A位之前被释放。
在蛋白质合成过程中，肽键的形成是在核糖体的大亚基内：
糖体的大亚基内有肽酰转移酶活性部位，其作用是催化肽键合成。
肽酰转移酶是催化肽键形成的酶。在蛋白质合成过程中，它催化核糖体A位tRNA上末端氨基酸的氨基与P位肽酰-tRNA上氨基酸的羧基间形成肽键。其结果，使A位的氨酰-tRNA上的多肽延长了一个氨基酸，而P位的氨酰-tRNA形成脱氨酰-tRNA。在原核生物中，肽酰转移酶是大亚基的23SRNA的成份。
转肽酶（transpeptidase）催化的肽键形成（peptide bond formation）过程。AA1AA2…AAn-1肽段位于核糖体P位，其中AAn-1连接于tRNA 3’端。AA1AA2…AAn-1肽段C端转移到A位AAn的氨基，形成新的肽键。因此，肽键的形成发生在肽酰转移酶活性部位，位于核糖体大亚基上。
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