51问答网 > 求分离，纯化,鉴定γ球蛋白的具体方法（包括原理，步骤，预期结果，注意事项）谢谢

求分离，纯化,鉴定γ球蛋白的具体方法（包括原理，步骤，预期结果，注意事项）谢谢

2025-04-04 07:20:02

推荐回答（1个）

回答1：

[原理]

血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：

用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。

[操作]

(1)盐析――中性盐沉淀：取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9％氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000r／min离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即为粗提的γ－球蛋白溶液。

(2)脱盐――凝胶柱层析

①装柱

洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。

②上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。

加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。

③洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20％磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH4+出现的情况。

合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。

(3)纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析：用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。

(4)浓缩――经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶，摇动2～3min， 3000r／min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。

(5)鉴定――乙酸纤维素薄膜电泳取乙酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液等样品点上。然后参阅实验二十四：乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。比较电泳结果。

[注意事项]

(1)凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。

(2)装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或DEAE纤维素混悬液不稀不厚，一般浓度为l：l，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象；加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。

(3)本法是利用γ-球蛋白的等电点与α-、β-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。

(4)电泳注意事项见实验二十四。

(5)凝胶贮存：凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如0.02％叠氮钠。保存于4℃冰箱内。若长期不用，应脱水干燥保存。脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于60～80℃烘干贮存。

(6)离子交换剂的再生和保存；离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以Cl型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。由于上述交换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般纤维素浸泡时间为3-4h。

离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用0.02％叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。使用时要加倍小心。

除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率高，所需时间短。将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高。

浓缩γ-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10℃以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如 SephadexG一25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。

[试剂]

(1)饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80℃水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

(2)葡聚糖凝胶G一25的处理：按每100ml凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G一25干胶 25g。称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸馏水约30ml，用玻璃棒轻轻混匀，置于90～100℃水温中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2～3次，然后加0.017mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。

(3)DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE纤维素14g称取，每克加0.5mol／L盐酸溶液15ml，搅拌。放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。加约l0倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4为止。加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。

(4)0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)

A液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H20)2.730g溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000ml。

B液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至 1000mL。

取A液77.5ml，加于B液22.5ml，混匀后即成。

(5)20%磺基水杨酸溶液

(6)奈氏(Nessler)试剂应用液

①贮存液；称取碘化钾(KI)7.58于250ml三角烧瓶中，用蒸馏水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振摇10min(此时产生高热，须冷却)，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾液为止，过滤上清液倾入100ml容量瓶，洗涤沉淀，洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至100ml。

②应用液：取贮存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。

(7)0.9％氯化钠溶液

(8)乙酸纤维素薄膜电泳有关试剂(见实验二十四)

(四)亲和层析

生物体中许多高分子化合物之间具有专—性可逆结合的特征，例如：酶蛋白和辅酶，抗原和抗体，激素与受体，核糖核酸与互补的脱氧核糖核酸等。生物分子间的这种专一性结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和力大小产生吸附和解吸作用而建立的层析方法称为亲和层析。

亲和层析的基本过程如下：具有亲和力的一对分子，其中一种分子作为配基，固定化结合在不溶性载体上装入层析柱成亲和柱，当含有另—种分子的混合液作为流动相流入亲和柱时，能与配基亲和结合的分子被吸附，其它杂质直接流出，再改变流动相的溶液，使配基与其亲和物解离从而解吸出待分离的分子来。

亲和层析中最常用的具有亲和力的生物体系有：

酶：底物、抑制剂、辅酶

抗体：抗原、病毒、细胞

外源凝集素：受体、载体蛋白

细胞：细胞表面特异蛋白，外源性凝集素

最新问答

能玩正当防卫3吗还有正当防卫3正版没有中文?繁体有吗?

我个子一米八六皮肤比较黑穿什么汉服比较好？

支付宝无法绑定小米手环，一直转个不停就是不能完成？求解

每天工作太过轻松，都不知道该干什么，人感觉不充实，心有时候很慌，该怎么办，救救我...

新买的不锈钢蒸锅，有什么方法可以防止锅底变黑吗？求大神帮助