分子生物学高人请帮忙。请教有关PCR的Tm值问题

首先告诉你，Tm值没什么用的，你要注意的是退火温度，比如这是我做16S rDNA的程序，
1）95度 10min（这个一般用94-95度，使DNA完全分开，这步一般固定）
2）95度 30秒（94度、95度都可以，这步几乎也是固定的）
3）退火温度 30-60秒（退火温度你设计引物时会有告诉你的，要是是大片段，将程序建议的退火温度减去5度，小片度就可以按照它给的温度，注意，退火温度是PCR的关键，所以一般需要摸索条件的）
4）72度 延伸时间（这步固定，延伸时间与你P的片段大小和你的Taq酶有关，一般是1-2kb/min，也就是说你做1kb大小的片段就用30-60秒，依次类推）
步骤2-4循环30次
5）72度 5-10min
6）15度 10min（此步可有可无）
希望可以帮到你！！
Tm值在你设计引物的时候才会有用，引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.不知道你懂了没？ 当然，我引物Tm值差5度的也有，照样P的很好，呵呵。

Tm值一般选择范围在55-65度，过低易出现非特异性PCR产物，过高不利于模板与引物的结合。通常在理论上我们选择Tm值在两条引物Tm值的中间值。

我曾经也遇到过这种问题，首先哪三种方法都是一个参考值，看过takara的说明书，计算方法也不一样，这个好像跟na离子浓度有关。如果你去订做引物的话，他们会给你两个数据，我印象中好像是1M，或0.5M钠离子。一般是0.5M是的温度选择正向和反向引物中下的作为Tm值。退火温度一般不超过Tm-5℃，如果这个值大于55℃的话，一般做得时候都用55℃，然后在优化pcr条件。如果不到55℃，一般选50度开始，如果条带特异性不好，就开始优化pcr条件