①在基因工程操作中为了获得重组质粒，一般用相同的限制性内切酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，以露出相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接形成重组质粒；也可以用不同的限制酶切割，含有目的基因的外源DNA分子和运载体，再用DNA连接酶连接，这样可以防止目的基因和运载自身环化等，故①错误；
②B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞不一定能产生特异性抗体，因此要进行抗体阳性检测，帅选出能产生抗体的杂交瘤细胞，再进行克隆化培养，以获得大量的单克隆抗体，故②错误；
③若要生产转基因抗病水稻，可利用农杆菌转化法，先将目的基因先导入到农杆菌中，再转入水稻细胞中，而大肠杆菌一般作为基因工程的受体细胞，故③错误；
④植物体细胞杂交，能克服远源杂交不亲和的障碍，培育出的新品种一定不是单倍体，故④错误；
⑤单抗制备过程中，诱导细胞融合之前，需将抗原反复注射给实验小鼠，目的是获得产生单一抗体的效应B细胞，故⑤正确．
故选D．
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