推荐回答（3个）
1、获取目的基因 2、形成重组DNA分子 3、将重组DNA分子导入受体细胞 4、筛选含有目的基因的受体细胞 5、目的基因表达
工具：限制性核酸内切酶（切割磷酸二酯键）、DNA连接酶（链接磷酸二酯键）、载体（主 要为质粒、原核小型环状DNA）
获取目的基因：若序列已知则用PCR扩增或化学方法合成：若序列未知则建立基因文库，从中获取
形成重组DNA分子：用同一限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因形成相同的粘性末端，再用目的基因链接
将重组DNA分子导入受体细胞：若受体为动物用显微注射法：若受体为植物用农杆菌转化法或花粉管法：若受体为微生物用氯化钙处理法（增加细胞壁通透性）
筛选含有目的基因的受体细胞：利用载体上的标记基因进行筛选
目的基因表达：个体水平上的性状，分子水平上的相应蛋白质、mRNA
先将载体和外源性目的基因合在一起，再导入生物体内。
基因转移是用物理的、化学的或生物学的方法将目的基因导入受体细胞并使之表达的一种技术。
物理方法
包括显微镜注射法、电脉冲介导法。显微注射法是应用特别的玻璃显微注射器在显微镜下把重组DNA导入靶细胞；电脉冲介导法又称电穿孔法，是指在高压电脉冲的作用下，使细胞膜上出现瞬间微小的孔洞，从而介导不同细胞之间的原生质膜发生融合，使外源DNA通过细膜上出现的瞬间小孔而进入细胞。
化学方法
有DNA-阳离子-二甲基亚砜法。基因转移的生物学方法包括细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法等。除以上三种方法外，又出现了颗粒轰击技术，就是将外源DNA包被在金属上，在电场中包被DNA的金属颗粒获得能量并以高速度运动，穿入靶细胞组织或器官内，由于这种金属颗粒可以涂成薄膜状，所以可实现较多细胞的基因转移同时发生，改进了其它物理方法基因转移效率低的缺点。
尽管物理法、化学法及生物学法在基因转移中被广泛应用，但由于基因转移效率较低，在短时间内难以取得基因治疗所需要的108~1012个转化细胞，因而在基因治疗的应用中仍然具有一定局限性，虽然对其进行了一些改造，如颗粒轰击技术的处理和应用，但也不能完全克服以上缺点，故而在基因治疗中不得不救助于其它技术，目前被广泛应用的一种技术就是逆转病毒载体技术（RMGT）。
逆转录病毒介导的基因技术
是目前将外源基因导入细胞的最有效的方法。此系统包括重组逆转录病毒载体和包装细胞两个部分，广泛应用的逆病毒载体LNL6是以Moloney鼠白血病病毒（MO-MLV）改建的。该病毒为RNA病毒，感染细胞后，其基因组RNA经逆转产生双链DNA拷贝插入宿主染色体形成前病毒，前病毒转录产生正链即为病毒基因组RNA。整个基因组从5′端到3′端依次是：5′长末端重复顺序（LTR）编码病毒内部结构蛋白的gag基因，编码蛋白的pol基因，编码外壳蛋白的env基因以及3′LTR和一个介子5′LTR和gag基因之间的包装信号。将病毒蛋白编码区gag、pol、env全部切除，代之以外源性目的基因即改建为病毒载体，保留了LTR和包装信号，是一种复制缺陷性病毒。同时，设计一种包装细胞系，其内含有辅助病毒基因组，即为包装信号缺乏的MO-MLV。当逆转录病毒载体进入包装细胞系时，载体基因就被包装形成完整的病毒颗粒，于是包装细胞系就成了制造病毒载体的生产细胞系。将靶细胞与生产细胞系其同培养或是收集含有载体病毒的生产细胞系上清液与靶细胞一起孵育，即可有效地进行基因转移。逆转录病毒载体技术的优点在于转染谱广，可感染包括人体在内的多种动物细胞类型，一次可感染大量细胞，转染率高达100%，转染的基因可为单拷贝和少数拷贝，能准确地整合到宿主细胞基因组中，整合率高，且能长期有效地表达。
RMGT仍有不足之处
①载体的滴度较低；
②是辅助病毒与载体病毒重组重新获得包装信号使病人面临感染辅助病毒的危险性；
③此载体只能整合至分裂相细胞；
④此载体容纳的外源基因量较少，不利于较大的基因的插入。
因此，人们在努力改造包装细胞系使其日趋完善，并广泛用于体外及体内的基因治疗中。在体外治疗中，为了增强肿瘤病人骨髓细胞对化疗药物的敏感性，将骨髓细胞和带有mdrI基因的逆转录病毒在体外共同培养后回输体内，获得了很高的疗效；在体内治疗中，用HSV-tk基因构建的逆转录病毒感染成纤维细胞后被直接注入鼠脑神经胶质瘤细胞中，再给予GCV治疗，转染了HSV-TK基因的胶质瘤细胞对GCV的易感性使得肿瘤完全消退了，目前，这项实验的临床应用阶段尚未报道
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