细胞爬片的制作方法

【爬片的准备】

1. 爬片：
24*24盖玻片，刚好用于6孔板。也可用更大的盖玻片，放在大的培养皿中爬片。

2. 盖玻片泡酸过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三
蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不
好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒、烤干。

3．盖玻片浸泡75%乙醇10分钟消毒，然后酒精灯上烤干，直接放入培养皿，开始种细胞。重点是玻片是干净的、无菌的。

4.盖玻片在液体中经常有贴壁吸附力，用一般镊子很难一次性夹起，将注射器针头针尖
向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以。

【细胞爬片】

1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使
玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。

3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可

4. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。注意细胞不能太密，否则容易掉片。

【细胞爬片的固定】

1. 细胞爬片取出后，PBS洗2遍。但比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的
细胞在洗的过程中有可能会脱落。

2.常用的固定液
1.） 冷丙酮，可用于一般的免疫组化染色。将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。

2. ）多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
3.） 95％乙醇，可用于免疫组化。
优点：穿透性强、抗原性保存较好。
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度室温固定
15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
4. ）甲醛(福尔马林)应用最广
优点：形态结构保存好，且穿透性强，
缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格
结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存。

【细胞爬片的组化染色】

1. PBS清洗标本 3次各2 min。

2. 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育 1次20min。（此步骤用于胞浆、胞核抗原）

3. PBS清洗标本3次各 2 min。

4. 3%H2O2孵育 15 min。

5. 余下步骤同石蜡切片组化染色。

单位实验室做过，小编顺便推荐一下细胞爬片是从上海晶安生物公司买的，实验效果不错.

细胞免疫荧光步骤：

1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子

具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）

取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；

3.PBS漂洗5min；

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；

5.PBS漂洗2次，每次5min；

6.1%BSA封闭30min；

7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；

8.PBS漂洗2次，每次5min；

9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；

10.PBS漂洗2次，每次5min；

11.5ug/ml DAPI染色2min；

12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:

2.5% DABCO (w
)

50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

细胞爬片可以买专门的爬片，几块钱一小包的，爬片用前泡酸，高压消毒（包括镊子和枪头）。把用过的24孔板清洗干净，一孔一片，很方便，又互不干扰。把细胞培养到对数生长期，消化后再滴上去，爬1-2天贴壁后（中间可加适量培养液），可在板子里一直做完。清洗时，将PBS滴在片子上即可，不要剧烈摇晃。需要照相时候，再取出来，细胞面贴在载波片上，最好用50%甘油，中性树脂贴不好，容易毁坏细胞形态。取爬片时候，可以用枪头和镊

师兄用的晶安生物24孔板细胞爬片还可以，希望可以帮到您。