如何对副猪嗜血杆菌进行实验室的分离与纯化

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎;猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)主要引起以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征的一种高度传染性呼吸道疾病。近年,副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌成为集约化猪场发病的重要病原之一,给养猪业造成重大经济损失。本文进行了副猪嗜血杆菌的分离鉴定与多重PCR检测Hps和APP方法的建立研究,主要研究内容如下: 1.副猪嗜血杆菌的分离鉴定研究 本研究从四川猪场采集的病猪心包积液中,采用加有NAD和小牛血清的TSB和TSA培养基进行接种培养,从病料中分离到1株疑似副猪嗜血杆菌。对分离的该株细菌进行鉴定:生长特性为其菌落在TSA上培养24-48h为光滑型,灰白色透明;将其在鲜血琼脂平板上水平划线,再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线,37℃培养24-48h,呈现典型的“卫星生长”现象,并且不出现溶血。细菌形态为具有多形性的革兰氏阴性细小球杆菌,直径约为0.5-1mm。生化鉴定具有氧化酶试验阴性,触酶试验阳性,脲酶试验阴性,吲哚试验阴性,硝酸盐还原试验阳性,能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖等,不发酵木糖、乳糖、甘露糖等特性。试验以琼脂扩散试验和分子生物学分型方法鉴定其血清型为血清12型。在小鼠致病性试验中,确定半数致死量为1.43×10~9CFU/mL。试验同时对其进行了分子生物学特性鉴定,设计副猪嗜血杆菌16SrRNA引物,进行PCR扩增该分离菌株的16S rRNA,并对其扩增产物进行克隆、测序和同源性比较,经比较分析该分离株同国外参考株的基因同源性达到98%以上。 试验表明:本研究成功从四川猪场分离和鉴定了1株副猪嗜血杆菌,并将其命名为HS SC-1。 2.多重PCR检测Hps和APP方法的建立 参考GenBank中APP apxIV基因和Hps 16S rRNA基因序列,用Primer premier 5.0设计软件,分别设计针对APP apxIV和Hps 16S rRNA两端保守基因的引物,并对设计的引物进行二聚体、同源性,互补性分析,试验设计扩增APP apxIVA基因片段为442bp,扩增Hps 16S rRNA基因片段为1090bp。 利用设计的引物分别对APP apxIVA和Hps 16S rRNA基因进行PCR扩增,并在单重PCR基础上,通过优化退火温度,引物浓度,镁离子浓度,建立可对APP和Hps同时检测的多重PCR方法。多重PCR扩增最佳体系为:10×buffer(Mg~(2+)-Free)2.5μl,25mM Mg~(2+)1μl,2.5mM dNTP 2μl,10pmol上下游引物0.8μl,2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl,DNA模板2μl,最后用无菌去离子水补至25μl。PCR反应程序为94℃预变性3min,然后94℃变性1min,55-57℃之间复性45S,72℃延伸1min,共30个循环,最后在72℃延伸10min,4℃保存。多重PCR特异性检测:对常见的病原体,猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门氏菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增,均不能扩增出任何片段。把DNA模板倍比稀释进行敏感性试验,能够检测到10pg的DNA量。 试验表明:本研究初步建立了多重PCR检测Hps和APP方法,该检测方法具有特异性好,检测灵敏性高,同步检测APP和Hps等优点。