分子生物学对细菌分类学的重要性

我们知道，生物的多样性决定了我们对生物必须鉴定和分类。我们所看到的各种动物猫、狗、猪等及各种植物玉米、大豆、水稻等似乎很好识别，但如果涉及到罕见的生物，那么想知道这种生物究竟属于我们所知道哪类生物时，就比较难了，如果是未知生物，就想知道它的亲缘关系，这就是生物分类学。分类就是根据生物的相似和相互关系确定它的分类位置。分类学的历史追溯到公元前384～322——亚里士多德时代，他的著作《动物历史》中有很多关于分类的论述。但是，真正的生物分类学之父应该是卡尔.林奈（Carl.Linnaeus，1707-1778）他提出的双名制命名生物现在被生物学界普遍使用，他的著作《自然系统》对现代生物分类学发展起了很重要的作用。达尔文的《物种起源》对现代生物分类学发展起着更为重要作用，达尔文根据地质学化石记录得出生物进化的论点，进而提出生物有共同祖先的学说。无论是亚里士多德的《动物历史》、林奈的《自然系统》还是达尔文的《物种起源》，所研究的生物分类都是高等动植物，这些生物具有复杂的形态结构，根据比较胚胎学、比较解剖学和化石等证据就可以研究，但是细菌分类学研究就落后很多，尽管细菌是地球上最古老的生物，它们已经生存了30多亿年，最早由1683年荷兰科学家列文胡克发明了显微镜，才第一次“看”到了它们，直到1829年，丹麦细菌学家革兰发明染色方法，开始了细菌的分类研究。细菌的形态结构简单又缺少化石记录，这就是细菌分类学起步较晚的原因，另外，直到18世纪末，德国科学家科赫找到了分纯细菌的方法，在这基础上才能对细菌进行鉴定和分类。

最早研究细菌分类的是Orla-Jensen[1]，1909年他提出，甲烷氧化细菌是所有细菌的祖先，因为地球早期没有有机物存在最先产生的细菌必定是自养菌，甲烷比其它物质更容易氧化，Kluyver和Van Niel[1]在1936年提出，球菌是最原始的细菌，因为球菌的形态学最简单，球菌的融合就形成杆菌，弧菌来自杆菌，螺旋菌来自弧菌等，这些研究是猜测性的，没有实验依据，随着人们对DNA分子认识及分子生物学技术的不断发展，人们认识到虽然细菌缺少化石记录，但细菌细胞内含的遗传物质DNA和RNA就记录着细菌演化的历史，尽管进化过程中会有基因突变，使基因组发生变化不同于原始的基因，但这种变化是缓慢的，基因组原始状态的遗迹依然存在。如果比较二种细菌的核苷酸，它们的序列很相似的，这就是说这二种细菌有很近的亲缘关系，同样，核苷酸的表达产物蛋白质分析对于细菌分类也是十分重要，体现在细菌的行为功能上，如细菌染色性，细菌鞭毛[2]，细菌对各种糖的利用情况，这些表型特征对于细菌分类同等重要。这就是多相分类，最先由Colwell[3]提出，多相分类包括表型、基因型、系统发育信息。

任何细胞要保持生命活动，必须不断合成蛋白质，合成蛋白质的器官就是核糖体。核糖体由蛋白质和核酸组成，分为大，小两个亚基，组成核糖体的核酸就是rRNA，rRNA约占细菌RNA总量的80％，存在于所有的细菌中，原核生物rRNA分为5SrRNA、16SrRNA、23rRNA，它们位于同一操纵子上，rRNA分子在长期进化中具有保守性，核苷酸序列变化较缓慢，应该是细菌系统分类发育标记分子（phylogenetic markers）。

自上世纪60年代开始，通过测定细菌DNA和rRNA进行细菌系统分类，主要方法简述如下：

一、DNA G­­­­­­­­­+Cmol％ GC含量差异即可确定DNA的不同，常用3种方法

浮力密度法[4]，熔解温度（Tm）法[5]，高压液相色谱法[6]，如果二种菌的G­­­­­­­­­+Cmol％有显著差异，就可以判定属于不同种，但是G­­­­­­­­­+Cmol％相同也不能判断属于同一个种，因此，G­­­­­­­­­+Cmol％只具有否定价值。

二、DNA-DNA杂交

由于G­­­­­­­­­+Cmol％测定不能判定细菌的亲缘关系，DNA-DNA杂交技术就弥补了G­­­­­­­­­+Cmol％的缺陷，它可以反应细菌菌种间的DNA序列相似性程度，即细菌的DNA同源性。根据测定结果杂交率进行细菌分类，测定方法通常分为滤膜分子杂交方法[7，8]和复性速率方法[9，10]，膜分子杂交方法将DNA固定于支持物滤膜上，属于固相杂交，而复性速率法在溶液中进行，属于液相杂交，复性速率法比膜杂交方法重复性好，但这二种方法都受杂交温度、离子浓度、DNA浓度、DNA片断大小和杂交时间影响，操作复杂、可靠性差、操作时间长，因此又发展了微孔板方法[11，12]，DNA分子杂交方法可以认为是基因鉴别同一菌种的金标准，如果杂交率大于70％就判定是同一种菌种。

三、DNA-rRNA杂交

研究表明，细菌rRNA保守性比整个基因组保守性大，于是建立了DNA-rRNA杂交技术[13，14，15]，该技术通常使用膜杂交技术和液相杂交技术，由于该技术操作复杂、费时，并且在细菌分类上其应用价值没有测定rRNA序列有意义，所以该技术没有被广泛应用。

四、rRNA寡苷酸测序技术

上世纪70年代，Carl Woese 等人[16，17]开始对细菌16SrRNA测序的研究，他们首先比较了原核生物16SrRNA寡核酸序列，进行细菌分类[18，19]，于是提出将生物界划分为三界：古细菌界（Archaebacteria），真细菌界（Eubacteria）和真核生物界（Eukaryotes），从而动摇了生物界由原核生物和真核生物组成的观念。1981年，Woese对细菌16SrRNA测定的寡序列进行了总结[20]，提出了一个生命进化树（图1），Woese 推测所有生物均由一个共同祖先Progenote进化。由于16SrRNA测序对于细菌分类有重要意义，新发现的菌种必须测定16SrRNA序列，我国学者谷海瀛发现的有医学价值的二种新菌[21，22]也进行了16SrRNA寡序列测定。

五、rRNA全序列分析法

由于PCR技术发展，测定16rRNA全序列变得更为容易，已有商品试剂盒出售，取代了寡核苷酸测序，使细菌系统分类更为完善了。1987年，Woses[23]根据细菌16SrRNA全序列结果提出更为精确的系统发育无根树，但是16SrRNA序列分析也有其局限性，从单一分子序列推测整个生物界的系统进化容易产生误差[24]，并且16SrRNA序列同源性更适用于属以上分类单元，对于属以下分类单元分辨率明显低[25]。

六、16S-23SrRNA间区

前面已论述，16SrRNA序列测定已成为细菌种属分类标准方法，但有其局限性，23SrRNA分子比较大（约3Kb），尚未在细菌的分类和鉴定中得到广泛应用，16S-23SrRNA间区（Intergenic Spacer Region，ISR）比16SrRNA相对变异大，因此，对于相近种及菌株的分类和鉴定应用16S-23SrRNA ISR 已广泛开展[26，27]，16S-23SrRNA ISR序列测定弥补了16SrRNA序列的缺陷，但有些菌株不能进行分型，要想广泛应用这一技术，需要建立更多菌株的16S-23SrRNA序列库，以便对比研究。

七、其他进化同源基因的测定

在真核生物中，尤其是动物界，生物大分子血红蛋白，细胞色素C等早已被用来研究进化的历史，由于功能保守，它的基因称为进化同源基因（Orthologues）.系统进化研究应用广泛的同源基因有热激蛋白（Heat shock protein）基因、Rnase P RNA基因（RnpB）.gyrB等。

1．热激蛋白主要是HSP60又称伴侣蛋白chaperonin，分为Cpn60，60-65KD抗原，细菌共同抗原系，许多细菌分子伴侣基因序列已被测定，利用分子伴侣进行系统进化已取得很大进展[28]。

2．RnpB：核酶（Ribozymes）是具有酶活性的RNA分子。RNase P 是核糖核蛋白复合体，不同种细菌RNase P RNA基因序列变化很大。Herrmann等人[29] 利用RnpB基因序列对衣原体3个种进行了鉴定，认为其序列的不同可作为衣原体种区分的标记。

3．gyrB：gyrB是促旋酶B亚单位的基因，Hiroaki等[30] 对分枝杆菌gyrB序列分析认为gyrB 序列比16SrRNA序列更好的区分相似种。日本已建立关于gyrB序列数据库，Suzuki等人[31]研究了海洋细菌gyrB基因序列认为种的水平上使用gyrB序列要优于16SrRNA序列，Dauga[32]比较了肠杆菌科不同属细菌的16SrRNA和gyrB序列。16SrRNA适用于较远的亲缘关系，而gyrB比较适用于种间或属间关系的比较。Tacao等人[33]比较了气单胞菌属16SrRNA和gyrB基因序列，gyrB序列很好地区别气单胞属内的菌种。

综上所述，尽管分子生物学技术发展日新月异，我们对生命理解更加深刻，但生命有无共同祖先尚无答案。Woese 提出的生命三界论已被普遍接受，但这三者进化关系如何？是否存在更可靠的进化分子时钟能够构建普适有根的系统发育树？尚不可知。在细菌学分类中，表型鉴定和分子生物学鉴定综合分析才能得出更为可靠的结论，但有时二者分类系统得出的结果是不一致的，无法统一，目前学术界尚不能解决这个问题，尤其对于分子生物学鉴定实验尚不能在临床实验室普遍开展，有待于进一步研究探索。

你到这里来问可是走错地方了。谁可能给你弄一篇4000字的综述出来？偷懒也不是这么偷的。建议去vip和CNKI上找几篇中文的这方面的综述，剪切粘贴就OK。另，还是建议楼主花点精力在分生上，以后发文章不做分生怎么发高影响因子的阿？